免疫共沉淀(Co-IP)技术是研究蛋白质间相互作用的有效工具，用于确定和证实蛋白质复合体中的特定相互作用。它的理论基础类似于免疫沉淀(Immunoprecipitation)原理，是利用抗体与细胞内的特定蛋白质结合，并通过蛋白A或G支持物吸附，同时捕捉到与该特定蛋白有相互作用的其他蛋白质。沉淀过程后，通过Western Blot检测确定相互作用的存在。

实验所需材料包括高速冷冻离心机，用于处理细胞或组织样本；缓冲液，包括PBS、modified RIPA Buffer；protein A beads，用于吸附抗体；相应抗体；以及用于上样和检测的2×SDS上样缓冲液。利用这些材料，执行如下步骤进行Co-IP实验。

首先，从细胞或组织中提取总蛋白，按照实验前的指导对细胞进行3000rpm离心，然后用PBS漂洗，并在modified RIPA Buffer中裂解，之后进行离心获取上清液。提取过程中，如果条件允许，可以分别处理细胞和组织样本。

接下来，使用一定量的抗体，将上清液在4℃下与抗体进行过夜孵育。同时，对protein A beads进行预洗处理，以去除任何可能干扰实验的杂质。然后将预洗的beads与抗体孵育的溶液混合，并在4℃下摇晃孵育2-4小时，确保抗体与beads充分偶联。

之后，进行离心和洗脱过程，首先离心去除沉淀下来的beads，然后使用modified RIPA Buffer进行3-4次洗涤，最后加入2×SDS上样缓冲液。将样品加热煮沸5分钟，以便准备进行Western Blot分析，检测相互作用蛋白质的存在。

实验过程中应关注一些关键点。抗原无法沉淀可能是因为抗原量过少，裂解效率低，或抗原与抗体不兼容。解决方法包括增加样本量、使用特异性抗体或更换裂解液。若沉淀下的抗体条带掩盖了目标抗原，考虑使用不同种属的抗体进行Western Blot实验。在某些情况下，实验可能面临蛋白产量低、非特异性条带多以及beads聚集等问题，通过加入蛋白酶抑制剂、增加beads量、提高样品量、调整裂解液条件等措施可以优化实验结果。

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文章来源：天狐定制

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