限制性内切酶在分子生物学中的关键作用及NEB的贡献

限制性内切酶，DNA剪刀，以其特异性识别并切割DNA序列的能力，对分子生物学的发展至关重要。这种酶结合用于扩增和连接核酸的酶，促进了DNA重组技术与现代分子生物学技术的诞生。经过半个多世纪的研究和发展，限制内切酶的应用已经从外源DNA的克隆和基因组图谱绘制扩展到更为复杂的应用，如表观遗传修饰的识别和图谱绘制，以及组合文库的高通量组装。此外，切刻内切酶（NEases）的发现和基因工程改造为DNA等温扩增等技术打开了大门。

限制性内切酶的发现

限制性内切酶的发现最早追溯到上世纪50年代初期，科学家发现，细菌具有抵抗噬菌体感染的能力。1965年，Arber提出，限制-修饰系统发挥着细菌抵御入侵噬菌体的功能，并假设这些酶能够结合在特定的DNA序列上。1968年，Meselson等人纯化并表征了第一个I型限制性内切酶EcoKI。1970年，Smith成功从流感嗜血杆菌中分离出在特定位点识别和切割DNA的限制性内切酶（II型），为之后限制性内切酶的广泛应用奠定了基础。

限制性内切酶的应用

应用于DNA图谱分析：Daniel Nathans于1971年通过使用限制性内切酶切割猿猴病毒SV40的基因组DNA，制作了第一个限制性酶切图谱，开启了分子生物学的新篇章。1975年前后，Southern blot和限制性片段长度多态性两大突破性技术的提出，对通过限制性内切酶进行DNA图谱分析领域产生了深远影响。1995年，在RFLP技术与PCR技术的基础上发展起来的扩增片段长度多态性技术用于DNA图谱分析。应用于经典克隆法：1973年，Cohen等人将EcoRI酶切生成的片段连接构建的质粒转入经过适当处理的大肠杆菌中，开启重组DNA技术的历史。1990年后，为了解决分子克隆过程中没有足够的插入片段与载体连接的问题，科学家们成功建立将PCR技术结合酶切连接的克隆方法并沿用至今。应用于甲基化分析：1997年，以AFLP技术为基础发展起来的甲基化敏感的扩增多态性技术建立，用于DNA的甲基化分析。应用于DNA文库构建：1995年提出的基因表达系列分析技术能同时对上千个转录本进行快速分析，限制性内切酶对其中标签的产生等方面起到关键作用。另外限制性内切酶也被用于靶标富集、测序基因分型、基因编辑、Golden Gate组装技术、染色质空间结构研究、实时DNA扩增和检测、开放染色质分析等技术中。

NEB与限制性内切酶

NEB与限制性内切酶的故事始于NEB创始人Donald Comb与NEB首席科学官/诺奖得主Richard Roberts的合作。彼时商业化限制性内切酶领域一片空白，Richard Roberts试图说服冷泉港实验室商业化限制性内切酶并将收益用于资助基础研究但未果，而Donald Comb刚刚基于相近理念于1974年成立了一家科研试剂公司。之后水到渠成，1975年，NEB成为第一家销售限制性内切酶的公司，并开展限制性内切酶相关的研究与开发项目。Richard Roberts在1975年创立了运行时间最久的生物数据库之一REBASE限制性内切酶数据库，后成为该领域的重要资源。

NEB在限制性内切酶发现中的贡献

NEB开展了一项伟大的限制性内切酶发现项目并延续至今，截止到2008年的统计，NEB科学家发现了500多种限制性内切酶。NEB也是最早开发重组型内切酶并持续提升酶性能的公司。为了提高产量、降低成本、避免污染活性，并提高批次间一致性，NEB首先将DNA重组技术应用于商业化限制性内切酶的生产。通过基因工程改造工作，NEB改良了内切酶的性能，例如选择性切割一条链的切刻酶的制备，以及通过离散氨基酸替代的定向改造产生多种新的序列特异性。此外，NEB推出了高保真（HF®）限制性内切酶，这种酶在非最适条件下表现出最小的或无星号活性，满足了在非最适条件下建立限制性内切酶反应的需求。

作为分子生物学发展历史上的重要书写者，限制性内切酶未来必将与更多激动人心的应用相结合，推动科学历史的进步与发展。而NEB仍然将是这段历史及未来的重要参与者及推动者。

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文章来源：天狐定制

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