A、基因工程常用的工具酶是限制酶、DNA连接酶,运载体不是工具酶,A错误;
B、一种限制酶能识别一种特定的核苷酸序列,并在特定的切点上切割DNA,B错误;
C、质粒是一种常用运载体,是拟核或细胞核外能自主复制的环状DNA分子,C正确;
D、DNA连接酶作用于两个DNA片段,而DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸加到已有的核苷酸片段上,因此DNA连接酶不可代替DNA聚合酶用于DNA的复制,D错误.
故选:C.
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