TMB（3,3',5,5'-四甲基苯胺）的显色原理主要基于其作为酶标记实验中的常用底物，在特定酶的催化作用下发生氧化反应，生成有色的氧化产物。以下是TMB显色原理的详细解释：

一、基本原理

TMB在酶标记实验中，如酶联免疫吸附测定（ELISA）中，作为过氧化物酶（如辣根过氧化物酶HRP）的底物。在过氧化氢的存在下，HRP能催化TMB发生氧化反应，生成蓝色的氧化TMB（或称为TMB的氧化产物）。这一反应过程涉及7-过氧基体环的消除，形成稳定的蓝色化合物。

二、具体步骤

酶标记物加入：将酶标记物（如HRP）加入待测样品中，使其与样品中的目标物（如抗原或抗体）结合。

底物TMB反应：随后加入TMB溶液，TMB在HRP的催化下，与过氧化氢反应，生成蓝色的氧化TMB。这一反应过程通常在避光条件下进行，以防止TMB显色对光的敏感性导致的颜色变化。

比色法分析：反应产物的颜色可以通过比色法进行定量分析。使用酶标记物的底物存在与否作为对照组，通过测量待测样品和对照组的吸光度差异，可以确定目标物的含量。通常，在370nm或620-650nm的波长下测定蓝色产物的吸光度，以评估反应的强度和目标物的浓度。

三、注意事项

光敏感性：TMB显色对光敏感，因此实验过程中应避免阳光或强光的照射，以防止颜色变浅或变淡，影响实验结果的准确性。

安全性：在反应过程中，应避免TMB与皮肤或眼睛直接接触，以免造成伤害。如发生意外接触，应立即用大量水冲洗，并及时就医。

反应终止：在某些情况下，为了停止反应或改变产物的颜色以便于测量，可以加入酸或另一种终止试剂。例如，加入硫酸可以使蓝色的氧化TMB变为黄色，此时可以在450nm处测定吸光度。

四、应用领域

TMB因其高灵敏度和无致癌性，在酶免疫分析（EIA）技术中得到了广泛应用。它主要用于抗原、半抗原或抗体的定量或定性检测分析，如ELISA、免疫斑点杂交、免疫组化以及氯和过氧化氢的检测分析等。

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文章来源：天狐定制

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