核苷酸是构成核酸链的基本单元，它们由碱基、戊糖和磷酸组成。碱基分为嘌呤碱和嘧啶碱两类，其中DNA中的嘧啶碱为胞嘧啶和胸腺嘧啶，RNA中的为胞嘧啶和尿嘧啶。DNA和RNA中还存在少量经过修饰的碱基。戊糖在DNA中为D-2-脱氧核糖，在RNA中为D-核糖。嘌呤和嘧啶与核糖结合形成核苷，与脱氧核糖结合形成脱氧核苷。核苷与磷酸结合形成核苷酸，脱氧核苷与磷酸结合形成脱氧核苷酸。在核糖的2′-羟基可以进行甲基化，这样形成的核苷或核苷酸称为修饰核苷或修饰核苷酸。根据磷酸和戊糖上的羟基结合的位置不同，核苷酸可分为2′-核苷酸、3′-核苷酸和5′-核苷酸。DNA中只有3′-脱氧核苷酸和5′-脱氧核苷酸两种类型。

核酸的一级结构由核苷酸的连接方式和排列顺序决定。1965年，R.W.霍利实验室揭示了酵母丙氨酸转移核糖核酸的一级结构。无论是DNA还是RNA，核苷酸之间都是通过3′，5′-磷酸二酯键连接起来的，即磷酸基团与左边戊糖的3′-羟基形成酯键，同时与右边戊糖的5′-羟基形成酯键。

利用核苷或单核苷酸作为原料，可以通过有机化学方法合成核酸。由于核苷酸是一个多官能团化合物，在化学合成中，需要将不希望发生反应的基团进行保护。例如，在将图1中的甲、乙两个3′-核苷酸连接生成3′-5′-磷酸二酯键时，需要保护甲的2′和5′-羟基、乙的2′-羟基和3′磷酸基团，以避免不必要的副反应。在合成二核苷一磷酸（图2）时，R1、R2、R3和R4都是保护基，用于确保核苷酸甲的3′磷酸基仅与核苷乙的5′羟基反应，生成甲-乙顺序的3′-5′-磷酸二酯键。在DNA合成中，由于脱氧核苷的2′位上是氢而非羟基，因此不必进行保护。

除了使用图2中的两种原料外，还可以将核苷乙改为5′-核苷酸，同时保护2′和3′位的羟基，与保护2′和5′羟基的核苷甲上的3′羟基反应（图3）。这种通过磷酸单酯和羟基缩合生成3′-5′磷酸二酯的方法称为磷酸二酯（合成）法。然而，当合成的寡核苷酸链增长时，由磷酸OH基团带来的副反应会逐渐加剧，导致合成产率急剧下降，因此该方法已被淘汰。改进的方法之一是采用适当的保护基来保护磷酸上的OH基团，再进行连接反应。这种方法称为磷酸三酯法。另一种改进方法是采用图5所示的路线，以保护的亚磷酰胺单体为原料，通过1-H-四氮唑活化后与羟基组分连接，先生成亚磷酸三酯，再氧化得到磷酸三酯，称为亚磷酰胺法或亚磷酸三酯法。

在磷酸三酯法和亚磷酸三酯法的基础上，发展起来的固相合成法，其基本原理是将要合成的寡核苷酸链的3′末端核苷先固定在一个不溶性的高分子载体上，然后从末端核苷开始逐步接长。接长的链始终被固定在载体上，过量的未反应物和分解产物通过过滤或洗涤除去。每次接长一个核苷，经历一次循环。当整个链增长到所需长度后，再将寡核苷酸链从固相载体上切落下来并脱去保护基，经过分离纯化得到所需产物。

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文章来源：天狐定制

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