酶标记抗体的方法多样，而制备HRP结合物，通常采用戊二醛二步法和过碘酸钠法。其中，过碘酸钠法因其简便性更为常用。

戊二醛二步法原理基于戊二醛作为一种双功能试剂，通过其醛基与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。标记步骤包括：

(1)称取25mg的HRP溶于1.25%戊二醛溶液中，于室温静置过夜。

(2)将反应后的酶溶液通过Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱，控制流速为1ml/1分钟，并收集棕色流出液。若体积超过5ml，则浓缩至5ml，置于25ml小烧杯中，缓慢搅拌。

(3)将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。

(4)用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml继续搅拌3至6小时。

(5)加入0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，放置于室温2小时。

(6)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，于4℃放置1小时。

(7)以3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗涤二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。

(8)将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后，以萘氏试剂检测。最后，以10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。

结果判定涉及定性及效价滴定、定量和克分子比值测定。通过特异性抗原与酶标记抗体进行双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验，然后使用酶的底物使沉淀弧显色，初步鉴定其活性。最后，通过直接ELISA法（或在正式实验系统中）对酶结合物进行滴定。

标记步骤相对简单，重复性好，但酶的利用率较低，一般只有2～4%的酶与蛋白质结合。常用的试剂及器材包括PBS、戊二醛溶液、碳酸盐缓冲液、赖氨酸溶液、PH7.8饱和硫酸铵溶液、萘氏试剂、聚乙二醇、纯化的特异性抗体、HRP、Sephadex G-25层析柱、搅拌器、分光光度计、离心机、透析袋、大、小烧杯、试管、吸管等。

扩展资料

酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记SPA等。酶标记物质量的好坏直接关系到免疫酶技术的成功与否，因此被称为关键的试剂。酶标记物中最常用的是酶标记抗体，它是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体，其次要有良好的制备方法。目前，高质量的酶(如辣根过氧化物酶，简称HRP)国内已有商品供应。高质量的抗体则可通过提取纯化而获得。在制备方法上，宜选用产率高、不影响结合物的活性和不混杂干扰性物质且操作简便易行的方法。

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文章来源：天狐定制

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