泛素是一种含有76个氨基酸、分子量约为8.6 kDa的小型蛋白质，在真核生物中普遍存在且具有高度保守性。人类基因组编码泛素的基因有四个：UBB、UBC、UBA52和RPS27A。泛素具有七个赖氨酸残基（K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63）和一个甲硫氨酸残基（M1）。泛素之间的连接主要通过赖氨酸和甲硫氨酸残基实现，形成的泛素链具有一定的拓扑结构，这影响着蛋白底物的修饰和功能。

蛋白质的泛素化是指将泛素分子添加到蛋白质底物上，这是一种动态的多步骤翻译后修饰过程，涉及真核生物学的多个方面。泛素化过程包括三个主要步骤：泛素分子的活化、结合和连接，分别由泛素激活酶（E1）、泛素结合酶（E2s）和泛素连接酶（E3s）完成。人类E1有UBA1和UBA6两种，E2有35种，E3有数百种。

E3酶具有HECT结构域和RING结构域之一。HECT结构域的E3连接酶先自身结合泛素，然后将泛素转移至底物蛋白；而RING结构域的E3连接酶使E2酶直接将泛素转移至底物蛋白。

泛素化可以有多种方式，根据泛素与底物的连接位点，目前已知的泛素化有M1、K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63、G76等九种，不同的泛素化方式调控着不同的功能。其中，与蛋白酶体降解相关的泛素化是K48。

泛素化位点的研究已经取得了巨大进展，全面的蛋白质组学分析确定了成千上万种蛋白质上的泛素化位点。大多数蛋白质在细胞生命周期的某个时刻都会经历泛素化。

研究蛋白质泛素-蛋白酶体降解的过程，主要是研究E3连接酶和底物蛋白之间的关系。

实验中使用的环己酰亚胺（Cycloheximide, CHX）是细胞内蛋白合成抑制剂，MG132是蛋白酶体抑制剂。

实验结果显示，底物蛋白的降解与蛋白酶体有关。随着E3泛素连接酶表达量的增加，底物蛋白的表达水平相应降低。当E3泛素连接酶的活性失活突变体表达量增加时，底物蛋白的表达水平无明显变化。通过敲低E3泛素连接酶的表达，底物蛋白的表达水平相应增加。过表达E3泛素连接酶时，底物蛋白的半衰期减少。敲低E3泛素连接酶时，底物蛋白的半衰期增加。这些结果说明E3泛素连接酶能够降低底物蛋白的表达水平。

免疫共沉淀方法用于检测两个蛋白质之间的相互作用，分为三种类型。通过文献或生物信息学分析E3泛素连接酶和底物蛋白的不同结构域，然后使用免疫共沉淀方法检测这些结构域之间的相互作用。

通常使用外源表达的泛素分子或内源泛素抗体来检测蛋白质的泛素化。由于泛素化是泛素分子与底物蛋白的共价结合，SDS无法破坏这种结合，因此在免疫印迹结果中可以看到多聚泛素化链的存在。

蛋白质泛素化是一种重要的蛋白质翻译后修饰，能够调控蛋白质的功能。通过确认底物蛋白的泛素链为K48链，可以研究K48泛素化在蛋白酶体识别和降解底物蛋白中的作用。通过过表达或敲低E3泛素连接酶，可以检测底物蛋白泛素化水平的改变。

体外泛素化实验可以排除体内复杂的环境因素，让E3泛素连接酶直接与底物蛋白作用，从而更有说服力地证明E3泛素连接酶对底物蛋白的泛素化作用。商业化的试剂盒提供了体外泛素化实验所需的UB、E1、E2、ATP和buffer。纯化E3泛素连接酶和底物蛋白进行体外泛素反应，可以检测底物蛋白的泛素化情况。

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文章来源：天狐定制

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